La leche materna es una fuente novedosa de células madre con un potencial de diferenciación multilinaje – Hassiotou – 2012 – CÉLULAS MADRE – La mejor biblioteca en línea de Wiley para minería monero

La glándula mamaria sufre una remodelación significativa durante el embarazo y la lactancia, que es alimentada por la proliferación controlada de células madre mamarias (MaSC). La escasez de muestras de tejido mamario humano en lactancia y el bajo número y estado de reposo de los MaSC en el seno en reposo han dificultado la comprensión tanto de la dinámica del MaSC normal como de los determinantes moleculares que impulsan su auto-renovación aberrante en el cáncer de seno. Aquí, demostramos que la leche materna humana contiene células madre (hBSCs) con propiedades de multilinaje. Células de la leche materna de diferentes donantes mostraron una expresión variable de genes de pluripotencia que normalmente se encuentran en células madre embrionarias humanas (hESC). Estos genes incluían los factores de transcripción (TF, por sus siglas en inglés) OCT4, SOX2, NANOG, que se sabe que constituyen el circuito de auto-renovación del núcleo de las hESC. Cuando se cultivaron en presencia de fibroblastos alimentadores embrionarios de ratón, una población de hBSC exhibió una morfología y fenotipo de colonia similar a ESC encapsulada y se pudo pasar a cultivos clonogénicos secundarios y terciarios. Mientras que los TF de autorrenovación se encontraron silenciados en el epitelio normal en reposo, se regularon drásticamente en las células de la leche materna cultivadas en condiciones de esferoides en 3D. Además, las hBSC se diferenciaron in vitro en linajes celulares de las tres capas germinales. Estos hallazgos proporcionan evidencia de que la leche materna representa una fuente novedosa y no invasiva de células madre específicas para el paciente con potencial multilinaje y establece un método para la expansión de estas células en cultivo. También resaltan el potencial de estas células para ser utilizadas como modelos novedosos para comprender la plasticidad de las células madre adultas y el cáncer de mama, con un uso potencial en bioingeniería y regeneración de tejidos. S TEM C ells 2012; 30: 2164–2174

Figura suplementaria S1. Análisis FACS ex vivo de la expresión del gen ESC por recién aislados células de la leche materna (n = 12). (a) Estrategia de activación utilizada para analizar la expresión de la proteína FACS por las células de la leche materna. Una primera compuerta se aplicó en el diagrama de dispersión frontal y lateral como se muestra. En esta puerta, solo las células nucleadas se seleccionaron mediante tinción con PI. La población de células nucleadas bloqueadas se separó luego en células muertas y viables, y solo estas últimas se analizaron para determinar la expresión del marcador. (b) Distribución de las diferencias estandarizadas en la intensidad de fluorescencia media en relación con los controles (SDT-C) para los genes ESC.

Figura suplementaria S3. Ensayo cuantitativo de PCR en tiempo real para la expresión de genes ESC adicionales mediante células de la leche materna y comparacion con fibroblastos humanos y hESCs. Se muestra la expresión de hTERT, REX1 y GDF3 para 12‐13 muestras de células de leche materna aisladas de diferentes participantes (S1-S13). Para hTERT y REX1, también se muestra la expresión de esferoides en el día 9 de crecimiento (D9), con una marcada regulación al alza de la expresión del ARNm en condiciones de esferoides. Se observa la gran variabilidad en la expresión de mRNA entre individuos. Las reacciones de PCR individuales se normalizaron frente a los controles internos (GAPDH) y se representaron gráficamente con respecto al nivel de expresión de los fibroblastos. Las barras representan la media ± SEM.

Figura suplementaria S4. Las células derivadas de la leche materna muestran rasgos similares a la ESC en ausencia de MEF en condiciones de crecimiento 2D y 3D, en contraste con los cultivos epiteliales mamarios derivados de reducciones mamoplásticas del tejido mamario en reposo. (a) Colonias adherentes similares a la ESC células de la leche materna Crecido en ausencia de MEFs. Micrografía de contraste de fase de una colonia con morfología ESC. Inmunotinción de estas colonias para la expresión de OCT4. (b) Los cultivos de células epiteliales mamarias derivadas de reducciones mamoplásticas del tejido mamario en reposo no expresaron genes ESC. (c) Se obtuvieron diversos tamaños y morfologías de esferoides del cultivo en 3D de hBSC. Se muestran esferoides en el pasaje 0‐2. (d) Coexpresión de genes ESC por células esferoidales individuales. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Barras de escala: 20 μm.

Figura suplementaria S5. Ejemplos adicionales de tiempo en el curso de la expresión de OCT4 por células de leche materna en condiciones de cultivo 3D. Ensayo de PCR cuantitativo en tiempo real para la expresión de OCT4 en 13 muestras de células derivadas de la leche materna (S1-S13) de 13 participantes en el día cero (D0 – células de leche materna fresca antes del cultivo) y hasta el día 9 (D9) del crecimiento de esferoides. Cada muestra se identifica con un color diferente. Los fibroblastos y hESCs se muestran en negro. Cada punto de tiempo se analizó por triplicado o duplicado según el número de células disponibles, y cada barra representa la media ± SEM. Las muestras S9‐ S13 se muestran solo para un punto de tiempo debido al material inadecuado para ejecutar más puntos de tiempo. Las reacciones de PCR individuales se normalizaron frente a los controles internos (GAPDH) y se representaron gráficamente con respecto al nivel de expresión de los fibroblastos humanos. Dependiendo de la muestra, se observó una respuesta variable de la expresión de OCT4 al cultivo en 3D, con algunas muestras que aumentaron la expresión de OCT4 a niveles significativamente más altos que los de hESCs (por ejemplo, S6, S12), y otras que aumentaron la expresión de OCT4 en forma marginal (por ejemplo, S3 ) o lo aumentó a niveles más cercanos a los de hESCs (por ejemplo, S5, S8, S9, S11).

Figura suplementaria S6. Diferenciación espontánea de hBSCs en células de las tres capas germinales. (a-h) Micrografías de contraste de fase de colonias adherentes derivadas de la leche materna diferenciadas en el día 14-21 del cultivo: (a) células epiteliales; (b) células mioepiteliales; (c) células de tipo neuronal; (d) células estromales de tipo fibroblasto; (e) células similares a los adoquines; (f ‐ h) tipos de células mixtas. (i) Inmunotinción de colonias mixtas de mama (CK14 + / CK18 +), células estromales (Vimentina, STRO-1), células similares a mioblastos (desmina, SMA), colonias endodérmicas (α-fetoproteína – AFP, OV6) y neuronas similares células (β-III-tubulina). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Barras de escala: 50 μm.

Figura suplementaria S8. Diferenciación dirigida de hBSC en condiciones 3D. (a) Inmunotinción de β-caseína en mamíferas cultivadas en condiciones de diferenciación mamaria. (b) Inmunotinción de insulina en pancreatosferas cultivadas en condiciones de diferenciación pancreática. (c) Inmunotinción de troponina T cardíaca en cardioesferas cultivadas en condiciones de diferenciación de cardiomiocitos. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (azul). Barras de escala: 20 μm.

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