Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica neuronal en la ética del protocolo de drosophila y ejemplos morales

Las dendritas son las proyecciones ramificadas de una neurona, y la morfología dendrítica refleja una organización sináptica durante el desarrollo del sistema nervioso. La arborización dendrítica neuronal larvaria de Drosophila (da) es un modelo ideal para estudiar la morfogénesis de las dendritas neurales y la función de los genes en el desarrollo del sistema nervioso. Hay cuatro clases de neuronas da. La clase IV es la más compleja con un patrón de ramificación que cubre casi toda el área de la pared del cuerpo de la larva. Anteriormente, hemos caracterizado el efecto de silenciar el ortólogo de drosophila SOX5 en la complejidad de arborización dendrítica neuronal de clase IV (NDAC) utilizando cuatro parámetros: la longitud de las dendritas, el área de superficie de la cobertura de dendritas, el número total de ramas y la estructura de ramificación . Este protocolo presenta el flujo de trabajo del análisis cuantitativo NDAC, que consiste en la disección de larvas, microscopía confocal y procedimientos de análisis de imágenes utilizando el software imagej. Más información sobre el desarrollo neuronal y sus mecanismos subyacentes mejorará la comprensión de la función neuronal y proporcionará pistas sobre las causas fundamentales de los trastornos neurológicos y del desarrollo neurológico. Introducción

Las dendritas, que son las proyecciones ramificadas de una neurona, cubren el campo que abarca las entradas sinápticas y sensoriales de la neurona de otras neuronas 1, 2. Las dendritas son un componente importante de la formación de sinapsis y desempeñan un papel fundamental en la integración de las entradas sinápticas, así como Propagando la estimulación electroquímica en una neurona. La arborización dendrítica (da) es un proceso mediante el cual las neuronas forman nuevos árboles y ramas dendríticas para crear nuevas sinapsis. El desarrollo y la morfología de la da, como la densidad de las ramas y los patrones de agrupación, resultan de procesos biológicos de varios pasos y están altamente correlacionados con la función neuronal. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método para el análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica neuronal en drosophila.

La complejidad de las dendritas determina los tipos sinápticos, la conectividad y las entradas de las neuronas asociadas. Los patrones de ramificación y la densidad de las dendritas están involucrados en el procesamiento de las señales que convergen en el campo dendrítico 3, 4. Las dendritas tienen la flexibilidad para el ajuste en el desarrollo. Por ejemplo, la señalización sináptica tiene un efecto sobre la organización dendrítica en la neurona somatosensorial durante la fase de desarrollo y en el sistema nervioso maduro 5. El establecimiento de conectividad neuronal se basa en la morfogénesis y la maduración de las dendritas. La malformación de las dendritas se asocia con alteración de la función neuronal. Los estudios han demostrado que la anomalía de la morfogénesis de la neurona da podría contribuir a las etiologías de múltiples enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington (EH), y lou aretha franklin respecto a la enfermedad de Gehrig / amiotrófica lateral la esclerosis (ELA) 6, 7, 8. Las alteraciones sinápticas aparecen en la etapa temprana de la EA, junto con la disminución y el deterioro de la función de las neuronas 7, 8. Sin embargo, los detalles de cómo la patología de la dendrita contribuye a la patogénesis en estas enfermedades neurodegenerativas siguen siendo elusivo.

El desarrollo de las dendritas está regulado por genes que codifican una red compleja de reguladores, como la familia wnt de proteínas 9, 10, factores de transcripción y ligandos en los receptores de superficie celular 11, 12. Drosophila da neurons consiste en cuatro clases (clase I , II III, IV), de las cuales las neuronas da de clase IV tienen los patrones de ramificación más complejos y se han empleado como un potente sistema experimental para comprender mejor la morfogénesis 13, 14. Durante la morfogénesis temprana, la sobreexpresión y / o el silenciamiento de los genes en la clase Las neuronas da IV dan como resultado cambios en los patrones de ramificación y la poda de dendritas 13. Es importante desarrollar un método práctico para el análisis cuantitativo de la arborización dendrítica neuronal.

Anteriormente, hemos demostrado que el silenciamiento de la ortóloga drosophila de SOX5, sox102f, condujo a dendritas más cortas de las neuronas da y una complejidad reducida en las neuronas da clase IV 15. Aquí presentamos el procedimiento de análisis cuantitativo para la complejidad del arborización dendrítica neuronal (NDAC) en drosophila. Este protocolo, adaptado de la metodología descrita anteriormente, proporciona un método breve para evaluar el desarrollo de las neuronas sensoriales. Ilustra el robusto etiquetado de la imagen y la neurona da en la pared del cuerpo larvario 16, 17, 18, 19 del tercer estadio. Es un protocolo valioso para los investigadores que desean investigar la NDAC y las diferencias de desarrollo in vivo.

Las dendritas de las neuronas da fueron rastreadas usando el software fiji imagej. El archivo se usó para estimar la longitud de la dendrita (figura 3). El silenciamiento de sox102f en neuronas da (N = 21) (UAS-sox102f-rnai / ppk-GAL4; UAS-GFP) condujo a una reducción significativa en el número de dendritas y una longitud de rama más corta con una estructura más simple en comparación con los controles (N = 20) (UAS-GFP; ppk-GAL4 / +) en la larva del tercer estadio de la chimenea de etanol (figura 6). Específicamente, las moscas en las que se silenciaba a sox102f mostraron una reducción en la longitud de dendrita promedio a 127 µm en comparación con 249 µm en los controles (p = 0.02), y tenían un área de superficie promedio más pequeña de 552,476 µm 2 en comparación con 847,571 µm en los controles ( p = 0,04). Además, el silenciamiento de sox102f dio como resultado un número menor de ramas y una estructura de ramificación más sencilla de los árboles con un total de 17 (17.3 ± 6.7), en comparación con 28 (28.4 ± 9.5) en los controles (p = 0.04). Se realizaron pruebas t de Student para comparar las diferencias entre los grupos, y el nivel de significación se estableció en 0.05.

Figura 1: esquemas de los parámetros de análisis de dendritas de drosophila da neuron. El panel (A) es la imagen original de una neurona da. (B) la longitud de dendrita fue el promedio de todas las longitudes de dendrita en todas las neuronas da medidas. (C) el área de superficie de la dendrita de la neurona se definió manualmente mediante la herramienta de imagen a mano alzada y la preventa. (D) este esquema muestra cómo contar el número total de ramas y analizar la estructura de ramificación de una neurona da. 1: cenador primario. 2: cenador secundario. 3: cenador terciario. 4: cenador cuaternario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: trazado representativo de las dendritas de una neurona da. Se realizó una imagen de una neurona da con un sistema de microscopio de fluorescencia confocal. (A) el primer rastreo se creó con un punto de inicio desde el cuerpo de la celda y el punto final de una dendrita usando la herramienta de complemento / segmentación. La línea azul (flecha blanca) representa el camino definido. Después de hacer clic "sí" (flecha roja), la línea cambia de color de azul a rojo. (B) haciendo clic en "camino final" Aparecerá púrpura (C). (A-C) muestra el proceso de rastreo de una sola dendrita; (D) La imagen trazada completa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: un ejemplo de análisis de ramificación. correr "analisis_render | analizar caminos esqueletizados" en el "segmentación" ventana de plugin Las rutas renderizadas y su número se obtuvieron seleccionando "renderizar todos los caminos | obtener resumen." la ruta se definió entre el cuerpo de la célula y las puntas de la dendrita, y una ruta puede incluir varias ramas; por ejemplo, los cenadores primarios eran las dendritas del cuerpo de la célula neuronal; los cenadores secundarios eran ramas de los primarios y así sucesivamente con los pilares terciarios, cuaternarios y quinarios. La estructura de la ramificación de dendritas se separó según los niveles de las ramas. Por ejemplo,% primario fue el número de sucursales dividido por el número total de ramificaciones, y así sucesivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: resultados representativos del silenciamiento de sox102f en neuronas da. El silenciamiento de sox102f en neuronas da (UAS-sox102f-rnai / UAS-GFP; ppk-GAL4) condujo a una reducción significativa de la longitud de la dendrita y una ramificación más corta con una estructura más simple en la larva del tercer estadio en comparación con los controles. Las diferencias entre moscas sox102f-rnai (UAS-sox102f-rnai / UAS-GFP; ppk-GAL4, N = 21) y el ejemplo de ensayo de logos de ethos pathos de control (UAS-GFP; ppk-GAL4 / +, N = 20) fueron moscas en (A) longitud de dendritas (B) área de la superficie del árbol (C) número total de ramas y (D, E) estructura de ramificación de las neuronas da. La prueba T de Student se realizó para el análisis estadístico. * indica significación estadística (p <0.05). Las barras de error son media ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las dendritas que inervan la epidermis son las regiones de entrada de las neuronas, y sus morfologías del comité de ética de la investigación humana determinan cómo la información es recibida y procesada por las neuronas individuales. El desarrollo de la morfología dendrítica refleja la modulación genética de la organización dendrítica. La drosophila larval da neuron del sistema nervioso periférico es un modelo importante para estudiar el desarrollo de dendritas debido a: 1) la similitud funcional con los mamíferos 11, 12; 2) cuatro distinciones de clase basadas en la estructura de dendrita 11, 12; y 3) los factores genéticos que regulan la morfogénesis. En este protocolo, presentamos el flujo de trabajo desde la preparación de larvas hasta el análisis de imágenes de las neuronas de Drosophila da. Los métodos describen los cuatro parámetros importantes para analizar en detalle las dendritas en las neuronas da, que son la longitud de las dendritas, el área de superficie, el número total de ramas y la estructura de ramificación. El paso crítico fue eliminar la mayor cantidad posible de tejidos de la pared corporal de la larva para exponer completamente las neuronas da para la obtención de imágenes y análisis. Puede haber algunas ramas cortas cortadas debido a la cantidad limitada de imágenes de proyección Z. Como este método es la medida relativa de la longitud de las dendritas en comparación con los controles, se debe tomar un gran número de imágenes para cada grupo de neuronas da para aumentar las áreas de cobertura de las imágenes de proyección Z.

Las neuronas da de Drosophila clase IV han sido el foco de la investigación relacionada con la morfología del árbol dendrite 15, 21, 22, 23. La morfogénesis del desarrollo del árbol dendrítico podría verse interrumpida por la pérdida o ganancia de la función del gen, lo que demuestra que el desarrollo de la neurona da es sensible a los cambios genéticos 24 Para los estudios genéticos, es importante analizar la morfología con precisión para comprender su impacto en las neuronas da. Las neuronas da de Clase IV son complejas, pero aún son accesibles para obtener imágenes de alta calidad porque están ubicadas justo debajo de la rama y la pared semitransparentes del cuerpo, casi en su totalidad en el espacio bidimensional. Las neuronas da marcadas con fluorescencia dinámica de GFP (ppk-GAL4; UAS-GFP) proporcionan un modelo fácilmente visualizado para investigar el desarrollo neuronal. La dirección del cambio en la morfología varía, los árboles pueden volverse excesivos o simplificados. Aquí, clasificamos estos cambios morfológicos por parámetros cuantitativos, e.G. La longitud de la dendrita, el área de la superficie, el número total de ramas y la estructura de ramificación de las neuronas da. Los resultados reflejan la respuesta en la expresión sox102f que regula el desarrollo neuronal, como se muestra en este estudio.

Nuestro protocolo se usó para mostrar los cambios morfológicos de las neuronas da de clase IV en moscas en las que se silenciaba el ortólogo de drosophila de las opciones de tratamiento de estenosis uretral SOX5, sox102f, lo que indica un papel funcional importante de SOX5 en el desarrollo de dendritas y morfogénesis. Las proteínas wnt son una familia de glicoproteínas secretadas que se han implicado en la regulación de la morfogénesis de la dendrita. Wnt2 y wnt7b promueven da y complejidad neuronal 9, 10. En la vía canónica wnt, esta activación es seguida por la activación de gsk3β, una serina-treonina quinasa, que a su vez activa la transcripción mediada por β-catenina 10, 25. Hemos encontrado anteriormente que el silenciamiento de SOX5 en células de neuroblastoma SH-SY5Y humano dio lugar a una represión significativa de la actividad de señalización de wnt y reguló la expresión de varios genes wnt, incluida una sobreexpresión de gsk3β 15. La expresión aumentada de gsk3β se ha asociado con las características distintivas de la AD , incluida la pérdida de memoria, las plagas de β-amiloide y la hiperfosforilación anormal de tau 26. El silenciamiento de SOX5 incrementó la expresión de gsk3β, lo que podría indicar un vínculo funcional entre SOX5 y gsk3β.

Las neuronas da de clase IV tienen las dendritas más complejas de todas las neuronas sensoriales. En este protocolo, hemos desarrollado un método para analizar la complejidad del árbol y las ramas para abstraer las propiedades de las neuronas da de clase IV en drosophila basadas en complementos y software disponibles de manera convencional. Se analizaron las imágenes que se tomaron de un microscopio confocal y la segmentación del complemento de un marcador neurita simple proporcionó una herramienta ideal para rastrear las ramas de dendritas 27, 28. Además, este método de cuantificación permite el análisis detallado de la complejidad de la dendrita presentando el ratios de varios niveles de ramificación desde el soma hasta el significado del ethos en dendrita más distante en inglés. Además, este método podría usarse para analizar otras clases de neuronas da. Por ejemplo, las neuronas de clase I dan dendritas secundarias a un lado de la pared del cuerpo; la clase II tiene ramas bifurcadas simétricamente; y las neuronas da de clase III tienen una mayor complejidad de ramificación y espigas. En resumen, proporcionamos un protocolo de imágenes y análisis de neuronas da de clase IV para análisis de dendritas neuronales en drosophila.

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